Nanobody klonering, expressie, zuivering en labeling in bacteriën voor superresolutie fluorescentie microscopie

Vraagstelling

Antilichamen worden gebruikt voor detectie van specifieke stoffen. De meeste antilichamen worden nog steeds verkregen door het immuniseren van dieren. Een van de nadelen is dat er veel variatie kan zijn in de kwaliteit van verschillende batches van antilichaam. Een manier om dit te voorkomen is door gebruik te maken van nanobodies. Deze kunnen worden verkregen uit onder andere kamelen en lama's. Doordat nanobodies veel kleiner zijn dan reguliere antilichamen, kan wanneer de eiwitsequentie bekend is het eiwit op grote schaal gezuiverd worden uit E. coli bacteriën. In dit project worden nanobodies verkregen die specifiek binden aan antistoffen uit ofwel muis of konijn. Deze kunnen gebruikt worden in plaats van reguliere secundaire antilichamen voor o.a. superresolutie fluorescentie microscopie. Drie verkregen DNA constructen moeten worden aangepast zodat de nanobodies verbonden zijn met een zogenaamde poly-histidine (His) tag. Daarna kunnen de nanobodies geïsoleerd worden uit bacteriekweken en gelabeld worden met een fluorescente tag.

Aanpak

Met behulp van de polymerase kettingreactie (PCR) werden de stukken DNA die coderen voor de nanobodies vermenigvuldigd en daarmee "uit de aangeleverde plasmiden gehaald". De PCR primers waren zo ontworpen dat er op de uiteinden speciale knipsites (restrictiesites) ingebouwd werden zodat de verkregen DNA's op de juiste manier in de donorplasmiden konden worden geplaatst. De aldus verkregen constructen (plasmiden) werden daarna overgebracht naar een zogenaamde expressiestam (een E.coli bacterie stam). Dit is voor alle drie constructen gelukt.

Resultaat

Met het stofje IPTG werd in de expressiestam de productie van de nanobodies gestimuleerd (drie constructen). Uit grote kweken van deze bacteriestammen werden vervolgens de eiwitten geïsoleerd met FPLC (fast protein liquid chromatography, twee constructen). Van een van de constructen is het gezuiverde eiwit daarna getagd met maleimide fluorescente dye (CF568).
Alle materialen (DNA constructen, gezuiverd eiwit en gelabeld eiwit) zijn overgedragen aan de opdrachtgever.