Handvat voor studie naar DNA reparatie

Vraagstelling

Onze cellen worden voortdurend blootgesteld aan mutaties. Deze kunnen leiden tot ernstige ziektes zoals kanker. Gelukkig worden de meeste mutaties meteen gerepareerd door o.a. mismatch repair enzymen. Om deze enzymen te kunnen bestuderen wordt een speciaal eiwit (dCas9, Cas9 is ook bekend van de CRISPR/Cas9 techniek) uit bacteriën gebruikt als een soort road block. De isolatie van dCas9 zou kunnen worden verbeterd door het te koppelen aan een peptide dat een AVI-tag heet. Het eiwit dCas9 met die Avi-tag kan in bacteriën worden geproduceerd en gekoppeld aan biotine. Deze biotinegroep wordt dan weer gebruikt als handvat om dCas9 te zuiveren en te gebruiken in de experimenten.

Aanpak

Met behulp van de zogenaamde fusie-PCR techniek is een stuk DNA gemaakt dat gekloneerd kon worden in een plasmide waarin de code voor dCas9 aanwezig is. Dit verkregen DNA construct is overgebracht naar een bacteriestam die het nieuwe eiwit kon maken en de biotinegroep kon koppelen.

Resultaat

Er zijn succesvol twee varianten gekloneerd. Uit grote bacteriekweken is vervolgens het met biotine gelabelde eiwit gezuiverd en aan de opdrachtgever afgeleverd.